ROS也叫活性氧（reactive oxygen species）是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一種具有氧化活性的化學(xué)物質(zhì)，包括過(guò)氧化氫、超氧陰離子等。ROS在正常生理?xiàng)l件下也會(huì)產(chǎn)生，但當(dāng)其產(chǎn)生過(guò)多或清除不足時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和疾病發(fā)生。

檢測(cè)原理

用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS廣泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA（二氯熒光黃雙乙酸鹽）是一種可指示的探針，其本身不具有熒光，但可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞，它會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無(wú)法穿過(guò)細(xì)胞膜，因此熒光探針會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無(wú)熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備，在最大激發(fā)波長(zhǎng)480nm和最大發(fā)射波長(zhǎng)525nm下檢測(cè)熒光

檢測(cè)步驟

一、裝載探針

刺激時(shí)間較短（通常為2 h以內(nèi)）的細(xì)胞：先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。

刺激時(shí)間較長(zhǎng)（通常為6 h以上）的細(xì)胞：先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

1、原位裝載探針（僅適用于貼壁細(xì)胞）

2、收集細(xì)胞后裝載探針（適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞）

二、檢測(cè)

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

收集細(xì)胞后裝載探針：用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

注意事項(xiàng)

① 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。

② 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否

良好。

③ 盡量縮短探針裝載后到測(cè)定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

④ 根據(jù)結(jié)果顯示的整體熒光強(qiáng)度的高低，可以適當(dāng)調(diào)整DCFH-DA探針的稀釋倍數(shù)以及孵育時(shí)間。